Polymerázová řetězcová reakce
Téměř všechny metody sekvenování jsou založeny na namnožení DNA polymerázovou řetězovou reakcí (polymerase chain reaction, PCR). Při ní se na krátkém úseku genomu napodobuje proces DNA replikace.
- Řetězce DNA se od sebe oddělí působením vysoké teploty.
- Na řetězce nasednou krátké oligonukleotidy, primery, které jsou reverzně komplementární k danému řetězci.
- DNA polymeráza od 3‘ konce primeru doplňuje nukleotidy po určitý čas anebo do konce templátového řetězce.
Tyto kroky se cyklicky opakují tak, že exponenciálně roste počet kopií úseku DNA mezi zvolenýma primerama.
U běžné PCR je specificita produktu daná specificitou použitých primerů. Pokud nasedají v genomu jenom na jedno místo, výsledkem bude vysoce koncentrovaná DNA namnoženého úseku.
Celogenomové sekvenování ale vyžaduje efektivnější přístup, který by nebyl závislý na znalosti sekvence templátové DNA. Proto se genomická DNA v přípravně fázi naláme na kratší úseky, ke kterým se naligují speciální sekvence, adaptory, sloužící jako jakési kotvy a primery zároveň. Od těch bude začínat PCR. Ale zároveň připojená sekvence umožní úsek DNA zachytit k nosiči, který bude úsek izolovat. Používají se k tomu dvě hlavní metody. Emulzní PCR a amplifikace na mostech.
