Základní kroky DNA mikročipového experimentu

Pro správnou analýzu dat DNA mikročipů je nutné znát kroky, které vedou k vytvoření finální datové matice.

1. Výroba mikročipového sklíčka

Způsob výroby a tedy typ samotného mikročipu přímo ovlivňuje způsob analýzy jeho dat.

2. Příprava vzorku

Nejprve se ze vzorku, který má být analyzován, vyizolují molekuly, které chceme studovat (DNA nebo mRNA). Molekula mRNA je přepsána do cDNA a amplifikována použitím RT-PCR. DNA je amplifikována pomocí PCR. Amplifikovaná DNA (nebo cDNA) je pak označena fluorescenčním barvivem (nejčastěji Cy3 nebo Cy5), a to buď přímo, nebo nepřímo. U nepřímého značení je nejprve do cDNA včleněna reagující skupina (obvykle primární amin), a pak je v oddělené reakci připojeno k této skupině fluorescenční barvivo.

3. Hybridizace

Dvouřetězcová molekula DNA (cDNA) je denaturována teplotou okolo 100°C. Při této teplotě jsou vodíkové vazby, které drží komplementární páry bází a tudíž helixové řetězce pohromadě, přerušeny a šroubovice se velmi rychle odděluje do dvou samostatných řetězců. Za specifických podmínek je denaturace DNA reverzibilní (vratná). Fluorescenčně označená jednořetězcová DNA má tendenci vázat se s komplementárními řetězci sondy na mikročipu, vytváří tak samostatný dvouřetězcový hybrid (duplex). Tento proces se nazývá hybridizace.

4. Skenování a kvantifikace
5. Normalizace

Tento poslední krok má za cíl odstranit z dat zdroje nežádoucího šumu a systematických odchylek a sjednotit rozdělení expresí u všech mikročipů.