Zpracování dat
Z LC MS/MS experimetu získame různe třídy informací. Primárním cílem jsou pořád kvalitativní informace o proteinovém složení vzorku. Dále měříme kvantitativní informace úměrné koncentraci konkrétních proteinů - tedy kolik naměřených spekter patří peptidům z jednoho proteinu nebo jaká je plocha pod křivkou píku. Protože LC-MS/MS systém dokáže odlišit modifikovaný peptid od nemodifikovaného (a to s přesností na konkrétní aminokyselinu), jsou posledním typem informace o výskytu postranslačních modifikací, např. fosforylace.
Zpracování dat z jedného LC MS/MS experimentu můžeme rozdělit do několika kroků:
- úprava základních dat (baseline substrakce, normalizace)
- příprava dat pro databázové vyhledávání
- příprava proteinové databáze, databázové vyhledávání
- zpracování výsledků z pohledu FDR
- výběr peptidových identifikací (PSMs)
- rekonstrukce seznamu „identifikovaných“ proteinů
- interpretace proteinového seznamu/ů
Úprava zakladních dat zahrnuje dva kroky:
- redukci profilových spekter na čárové
- rekalibraci
Z experimentu ziskáme profilové spektra (příklad na obrázku), které se pro další fáze vyhodnocováni redukují na čárové spektra.
Postupů na výpočet čárového spektra je více. Nejběžnejší jsou lokálni maxima, nebo častečná integrace plochy pod píkem. Částečnou integrací rozumíme metodu, kdy se profilové spektrum diskretizuje v pevných intervalech a všechny hodnoty, které patří jednomu píku se sečtou. Diskretizace se využívá i pro výpočet lokálních maxim.
Poté se provádí rekalibrace, důvodem je systematická odchýlka naměřené m/z hodnoty, která se mění v čase (červená čára):
.png)
Pro rekalibraci se využívá typicky jedna z metod:
- Interní rekalibrace – Na začátku měření se spočíta chyba m/z prekurzoru a ta se odečte v celém záznamu
- Lockmass – lockmasa je jedna z kontaminat pozorovaných pri LC MS/MS experimentech. Od ostatních se líší tím, že MS/MS systém prochází během celého měření. Její odchylka se tak stanovuje (a pak odpočítavá) v krátkých intervalech.
- Podle identifikovaných peptidů – využití statistického modelovaní odchylek m/z v celé délce měření po identifikaci peptidů
