2D gelová elektroforéza
Principem gelové elektroforézy je separace proteinů v gelu ve dvou dimenzích a to na základě hmotnosti a pH.
Postup můžeme rodělit do těchto sedmi kroků:
- Proteiny jsou extrahované ze vzorku.
- Získaný vzorek se umístí na gel a proteiny migrují až do té doby, kdy dosáhnou izoelektrického bodu (pokud je jejich náboj nula). Důležitý je výběr gelu, který musí být dostatečně pórovitý, aby umožnil proteinům pohyb (agaróza nebo polyakrylamidový gel).
- Tak se proteiny oddělí vzhledem ke své hmotnosti a náboji.
- Následně proteiny necháme pohybovat se na základě pH v druhé dimenzi.
- Nakonec je gel obarvený, aby se detekovali jednotlivé spoty.
- Když jsou spoty zabarvené, gel se může vyfotit.
- Intenzita pixelů koreluje s množstvím proteinu, používá se speciální SW pro analýzu spotů. Všimněte si analogii s analýzou obrazu u DNA mikročipů.
Takto vypadá obrázek 2D gelu. Tmavé spoty jsou obarvené peptidy a proteiny, červené a zelené kruhy představují oblasti nalezené analýzou obrazu. Jak vidíte, není to ani zdaleka perfektní, proto je nutno na rozdíl od mikročipů obrázek ručně upravit (rozmístnit kruhy) a znovu spustit analýzu obrazu.
Takto vypadají data:
| SSP | wt_A | wt_A | wt_A | wt_S |
| 101 | 2338,84 | 2078,42 | 2625,1 | 2550,54 |
| 102 | 118,92 | 68,65 | 125,8 | 109,66 |
| 103 | 221,89 | 55,32 | NA | NA |
| 104 | 215,3 | 189,02 | 220,28 | NA |
| 105 | 106,56 | NA | 238,36 | NA |
| 106 | 328,32 | 226,46 | 522,52 | 1281,75 |
| 107 | 259,8 | 228,13 | 340,37 | NA |
| 108 | 1439,72 | 1213,28 | 1187,43 | 1353,14 |
řádky jsou peptidy, sloupce jsou vzorky
Podobně jako u mikročipů, je nutno hodnoty mezi vzorky normalizovat aby se daly porovnat. Doporučujeme loess nebo kvantilovou normalizaci.
