Time-of-flight spektrometrie

TOF spektrometr separuje ionty na základě času, kterým putují k detektoru. Obecně, ionty s větší hmotností putují pomaleji než ionty s nižší hmotností. Také, ionty s vyšším nábojem putují rychleji než ionty s nábojem nižším, jak ilustruje obrázek níže. V tomto případě je ionizační zdroj laser a matice na které jsou proteiny:

TOF (time-of-flight) závisí na hmotnosti proteinů nebo přesněji na jejich m/z (hmotnost k náboji) a představuje sumu těchto časů:

TOF = t_a + t_D + t_d, kde

         t_a  je čas letu v akcelerační oblasti,   
         t_D  je čas přeletu v oblasti s nulovým elektrickým polem
         t_d  je čas detekce
 
TOF lze aproximovat pouze pomocí  t_D , mass-to-charge ratio je pak vypočteno podle:

m/z = B( t_D - A)^2

A a B jsou stanoveny pomocí kalibrace.

Nejpoužívanější jsou dvě technologie:

• Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation (MALDI)-TOF
• Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation (SELDI)-TOF

Proteiny vzorku jsou před samotnou analýzou upevněny na podklad, který se v závislosti od typu hmotnostní spektrometrie liší. Jeho úkolem je také absorbovat energii v ionizátoru a předat ji vzorku a tak usnadnit jeho ionizaci.

Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation (MALDI)-TOF

U MALDI see jedná o energii-absorbující matrici (matrix), což je nejčastěji organická kyselina s aromatickým jádrem:

Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation (SELDI) – TOF

SELDI využívá proteinový čip (s několika - obvykle osmi - spoty), opatřen speciálním chromatografickým povrchem, takže se na povrch váží různé proteiny v závislosti na svých chemických vlastnostech a vlastnostech čipu. A až potom dojde k nanesení matrice, která se vzorkem vytvoří krystaly.

Existuje několik druhů čipů (IMAC30, H50, NP20...), které se liší svým aktivním povrchem (anionický, kationický, kovový, normální fáze, hydrofobický, …) a proto také přednostně vážou jiné molekuly.

Výhodou SELDI je, že máme možnost odmýt látky, které by jinak ovlivňovali spektrum vzorku (např. močovina používaná k přípravě vzorku, nebo Na+ ionty přítomné fyziologicky ve vzorcích).

Čipy pro SELDI-TOF:

Kvantitativní hodnoty  proteomu jsou také ovlivněné různými zdroji variability (experimentální i biologické). 

Velmi velké rozdíly jsou mezi různými typy použitého čipu, viz tabulka níže, která zobrazuje procenta společně detekovaných píků stejného vzorku analyzovaného pomocí SELDI a čtyř různých čipů. Tabulka není symetrická, je nutno ji číst po sloupcích, např: Ze všech píků nalezených na čipu IMAC30 se jich našlo 19 (47.5%) také na čipu H50:

Jak může způsob spracování vzorku ovlivnit výsledek analýzy demonstruje obrázek níže, který ukazuje píky profilů tří odlišných SELDI čipů. Jde o vzorky zpracované 4 různými způsoby. (Banks et al, Clinical Chemistry 2005)

Tato heatmapa ukazuje, že hierarchické shlukování profilů vzorků z tabulky výše, ze 4 typů SELDI sklíček, by mělo vzorky shluknout spíše podle vzorky než podle typu čipu:

legenda: IMAC30, H50, NP20zas, NP20kys