Slovník | Vyhledávání | Mapa webu
 
Analýza genomických a proteomických datAnalýza genomických a proteomických dat Analýza dat hmotnostní spektrometrie Time-of-flight spektrometrie

Logo Matematická biologie

Time-of-flight spektrometrie

TOF spektrometr separuje ionty na základě času, kterým putují k detektoru. Obecně, ionty s větší hmotností putují pomaleji než ionty s nižší hmotností. Také, ionty s vyšším nábojem putují rychleji než ionty s nábojem nižším, jak ilustruje obrázek níže. V tomto případě je ionizační zdroj laser a matice na které jsou proteiny:

TOF (time-of-flight) závisí na hmotnosti proteinů nebo přesněji na jejich m/z (hmotnost k náboji) a představuje sumu těchto časů:

TOF = ta + tD + td, kde


         ta  je čas letu v akcelerační oblasti,   
         tD  je čas přeletu v oblasti s nulovým elektrickým polem
         td  je čas detekce
 
TOF lze aproximovat pouze pomocí  tD , mass-to-charge ratio je pak vypočteno podle:

m/z = B( tD - A)^2


A a B jsou stanoveny pomocí kalibrace.

Nejpoužívanější jsou dvě technologie:

  • Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation (MALDI)-TOF
  • Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation (SELDI)-TOF

Proteiny vzorku jsou před samotnou analýzou upevněny na podklad, který se v závislosti od typu hmotnostní spektrometrie liší. Jeho úkolem je také absorbovat energii v ionizátoru a předat ji vzorku a tak usnadnit jeho ionizaci.

Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation (MALDI)-TOF

U MALDI see jedná o energii-absorbující matrici (matrix), což je nejčastěji organická kyselina s aromatickým jádrem:

 

Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation (SELDI) – TOF

SELDI využívá proteinový čip (s několika - obvykle osmi - spoty), opatřen speciálním chromatografickým povrchem, takže se na povrch váží různé proteiny v závislosti na svých chemických vlastnostech a vlastnostech čipu. A až potom dojde k nanesení matrice, která se vzorkem vytvoří krystaly.


Existuje několik druhů čipů (IMAC30, H50, NP20...), které se liší svým aktivním povrchem (anionický, kationický, kovový, normální fáze, hydrofobický, …) a proto také přednostně vážou jiné molekuly.

Výhodou SELDI je, že máme možnost odmýt látky, které by jinak ovlivňovali spektrum vzorku (např. močovina používaná k přípravě vzorku, nebo Na+ ionty přítomné fyziologicky ve vzorcích).

Čipy pro SELDI-TOF:

Kvantitativní hodnoty  proteomu jsou také ovlivněné různými zdroji variability (experimentální i biologické). 

Velmi velké rozdíly jsou mezi různými typy použitého čipu, viz tabulka níže, která zobrazuje procenta společně detekovaných píků stejného vzorku analyzovaného pomocí SELDI a čtyř různých čipů. Tabulka není symetrická, je nutno ji číst po sloupcích, např: Ze všech píků nalezených na čipu IMAC30 se jich našlo 19 (47.5%) také na čipu H50:

  H50 IMAC30 NP20acid NP20alkaline
  N % N % N % N %
H50 75 100 19 47,5 24 52,2 56 59,6
IMAC30 19 25,3 40 100 19 41,3 21 22,3
NP20acid 24 32 19 47,5 46 100 30 31,9
NP20alkaline 56 74,7 21 52,5 30 65,2 94 100
% odlišných m/z 15 20 15 37,5 12 30 28 29,8

 

Jak může způsob spracování vzorku ovlivnit výsledek analýzy demonstruje obrázek níže, který ukazuje píky profilů tří odlišných SELDI čipů. Jde o vzorky zpracované 4 různými způsoby. (Banks et al, Clinical Chemistry 2005)

Tato heatmapa ukazuje, že hierarchické shlukování profilů vzorků z tabulky výše, ze 4 typů SELDI sklíček, by mělo vzorky shluknout spíše podle vzorky než podle typu čipu:

legenda: IMAC30, H50, NP20zas, NP20kys

 

 

 
vytvořil Institut biostatistiky a analýz Masarykovy univerzity | | zpětné odkazy | validní XHTML 1.0 Strict