Slovník | Vyhledávání | Mapa webu
 
Analýza genomických a proteomických datAnalýza genomických a proteomických dat Analýza dat hmotnostní spektrometrie Liquid Chromatography MS/MS

Logo Matematická biologie

Liquid Chromatography MS/MS

LC-MS/MS je technika tandemové hmotnostní spektrometrie. Tak jako u jiných MS metod, získaný biologický materiál nejprve přocházi různými laboratorními postupy, kde se čistí, koncentruje a nakonec enzymaticky štěpí na peptidy. Dále vzorek postupuje do LC MS/MS systému. LC je zkratka pro průtokovou chromatografii (liquid chromatography). Vzorek přechází systémem kapilár, ve kterém dochází k separaci peptidu dle chemicko-fyzikálních vlastností. Z průtokového chromatografu vzorek postupně vtéká do MS/MS systému, kde se jednotlive peptidy ionizují a pak detekují, stejně jako u jiných MS metod, jak jsme psali výše.

Výsledkem jednoho takového měření jsou základní data, které obsahují naměřená fragmentační spektra = ta se porovnávají s teoretickými spektrami odhadnutými ze známé sekvence proteinu daného organizmu. Ze sady identifikovaných peptidů se pak rekonstruuje sada proteinů pravděpodobně přítomných ve vzorku. Výsledkem je tabulka obsahujíci identifikované peptidy a proteiny, některé jejich chemicko-fyzikální vlastnosti, intensitu signálu a další parametry využívané hlavně pro kontrolu kvality. Tyto tabulky jsou pak hlavním zdrojem dat pro statistickou analýzu.

Experimenty je možno třídit z různych hledisek. Pro vyhodnocování je nejdůležitejší rozdělení dle komplexity vzorku (počtu očekávaných proteinů). Nejjednodušším případem je identifikace proteinů ze spotů 2D gelů (2D-SDS-PAGE). Zde předpokladáme jenom jednotky proteínů v jednom spotu. Na druhé straně můžeme vyhodnocovat až desítky vzorků (různých spotů nebo biologických replik). Pro tenhle typ experimentu je výhodné automatizované spracování výsledků měření.

Komplexnejším případem je identifikace proteinů v proužcích z 1D gelu (1D-SDS-PAGE), kde očekávame jednotky až stovky proteinů a často vyhodnocujeme jenom jednotky vzorků.

Nejkomplexnejší materiál představuje celobuněčný lyzát používaný např. pro relativní porovnání dvou buněčných linií – wild-type vs. mutant. U tohoto typu experimentu očekáváme ve vzorku tisíce proteinů, zatímco pracujeme jenom s několika vzorky.

Dále můžeme LC-MS/MS experimenty dělit dle použitého značení. Analogii k jednokanálovým mikročipům představuje tzv. label-free postup, kdy se vzorek neznačí a v jednom měření se měří pouze jeden. V případě, že chceme měřit najednou více vzorků, musíme je označit, podobně jako se označují vzorky fluorescenčním barvivem u mikročipovýc experimentů.

Pro značené postupy existujú různe typy značek, ze kterých nejběžnějšími jsou SILAC (stabilní izotopové značení aminokyselin v buněčných kulturách), kterým je možné označit 2 nebo 3 druhy vzorků (např. jedna značka pro wild-type kultury a druhá pro mutantní) nebo iTRAQ (izobarické značky pro relativní a absolutní kvantifikaci), který existuje v sadách pro 4 nebo 8 vzorků. U SILAC značek se využívá známých posunů hmotnostních spekter. V experimentu s využitím iTRAQ značek se nejdříve zjistí intenzita peptidu se všemi značkami, pak v druhem kroku při fragmentaci peptidu docházi k odštěpení značky a měří se jich relatívní zastoupení.

 
vytvořil Institut biostatistiky a analýz Masarykovy univerzity | | zpětné odkazy | validní XHTML 1.0 Strict