Analýza genomických a proteomických datAnalýza sekvencí DNA Predikce genů a anotace sekvence DNA Anotace ab initio - od začátku Predikce eukaryotických genů

Analýza genomických a proteomických dat | Analýza sekvencí DNA |

Sekvence |

Základní informace | Výstupy z výukové jednotky |

Genom | Sekvenování genomu |

Polymerázová řetězcová reakce |

Emulzní PCR | Amplifikace na mostech |

Celogenomové sekvenování |

Pyrosekvenování | Sekvenování pomocí syntézy | Iontové polovodičové sekvenování | Sekvenování jedné molekuly DNA |

Sangerovo sekvenování | Sestavení sekvence |

Postup sestavování kontigu | Detekce mutací v kontigu |

Genetické databáze |

Vyhledávání v databázích |

Přístupové číslo sekvence |

Sekvence v GenBance | Stahování sekvencí | Informační zdroje pro proteiny |

BLAST-Vyhledávání podobných sekvencí |

Nukleotidový blast | Proteínový blast | Blast využívající překlad DNA do sekvence aminokyselin a opačně | Prohledávání specifických databází |

Vícenásobné vyhledávání | Výsledek a interpretace | Taxonomie nebo fylogeneze nalezených záznamů |

Predikce genů a anotace sekvence DNA |

Základní informace | Výstupy z výukové jednotky | Komparativní anotace |

Nejistota v anotaci |

Anotace ab initio - od začátku |

Příprava sekvence do genetických databází |

Údaje pro vkládání sekvencí |

Alignment |

Progresivní alignment | Alignování velkých souborů sekvencí |

Praktické problémy s alignmentem a jejich řešení |

Modelování příbuznosti sekvencí DNA |

Základní informace | Výstupy z výukové jednotky |

Substituční model |

Substituce |

Tranzice a transverze |

Genetické vzdálenosti | Parametry substitučního modelu |

Vektor frekvence bází | Frekvenční matice | Mutační rychlost |

Příklady nejběžnějších substitučních modelů | Heterogenita rychlosti evoluce mezi pozicemi |

Γ rozdělení | Proporce nevariabilních pozic |

Výběr substitučního modelu |

Hierarchický test poměru věrohodností | Akaikovo informační kriterium | Bayesovo informační kritérium |

Inserce a delece |

Metoda nejbližšího souseda |

Sestavování vícenásobného alignmentu | Testování substitučního modelu | Vizualizace předběžných výsledků |

Ověření stability uzlů stromu – bootstrap |

Základní informace | Výstupy z výukové jednotky | Algoritmus bootstrapu |

Pseudoreplikace alignmentu | Sumarizace bootstrapu |

Použití bootstrapu |

Fylogenetika |

Základní informace | Výstupy z výukové jednotky |

Čtení fylogenetického stromu |

Fylogenetický strom formálně | Fylogenetický strom intuitivně | Počet možných stromů | Vlastnosti fylogeneze |

Topologie | Vzdálenosti taxonů |

Ancestrální sekvence | Určení kořene stromu | Využití fylogenetické informace |

Maximální věrohodnost |

Věrohodnost (L, likelihood) |

Scenáře ancestrálních stavů |

Krajina stromů | Heuristické vyhledávání |

Záměna nejbližšího souseda | Rozdělení a spojení stromu | Lezení do kopce |

Bayesiánská inference |

Markovovy řetězce Monte Carlo | Efektivita prohledávání krajiny stromů | Priory |

Neinformativní prior |

Autokorelace MCMC | Burnin | Posterior |

Hustota posteriórní pravděpodobnosti |

Diagnostika konvergence |

Divergence druhů |

Oddělení druhů | Supermatice |

Koalescence |

Superstromy |

Predikce eukaryotických genů

V eukaryotickém genomu tvoří pojmenované geny často méně než 2% celé genomické sekvence. Nalézt takové geny je proto komplikovanější než u prokaryot a vyhledávání ORF není dostatečné.

Otázka: Proč nestačí vyhledat u eukaryot ORF a následně vytřídit vhodné kandidáty na základě promoterových sekvencí jako u prokaryot?

Skutečných ORF by bylo velice málo v porovnaní s možnými kombinacemi start a stop kodonů. Délka genů je mnohem variabilnější než u prokaryot a většina eukaryotických genů obsahuje introny, které můžou posouvat ORF při přímém čtení.

Struktura genů u eukaryot je komplexnější a výjimkou nejsou ani geny, které mají délku řádově v 10⁵ bp. Velmi dlouhé geny budou rozděleny na exony a introny, přičemž introny budou výrazně delší než exony (Obr. 3). Pro účely predikce genů je dobré si uvědomit, že eukaryotický gen se přepisuje do mRNA včetně nepřekládaných oblastí na 5‘ a 3‘ koncích (UTR) a intronů. UTR ale nejsou predikovány a přesný rozsah přepisovaného genu není z predikcí patrný. Predikují se kódující sekvence od start po stop kodon a určuje se lokace a počet intronů a pro zjištění UTR oblastí je potřebné osekvenovat mRNA molekulu. Zároveň tyto experimenty poskytují důkazy o expresy daného predikovaného genu, zlepšují určení intronů a případně poskytují informace i o alternativním sestřihu u daného genu.

Predikce eukaryotických genů je založena na vyhledávání regulačních sekvencí pro transkripci. Příklady takových sekvencí jsou:

TATA box = TATAAA (podobné Pribnowově sekvenci u prokaryot - TATAAT)
iniciační element = YYANWYY
GC box = GGGCG
CAAT box = GGCCAATCT
BRE (z angl. B recognition element) = SSRCGCC

Symboly N, S, R, Y a W v sekvencích představují kódy nejistoty v DNA (Tab. Contig.1). Jak konkrétně bude daná sekvence vypadat u toho kterého genu a organizmu může být značně specifické a/nebo variabilní. Na jejich vyhledávání je proto znovu potřeba sofistikovanějších metod, jako např. skryté markovovy modely, neurální sítě nebo diskriminace vzoru. Všechny tyto metody mají jedno zásadní omezení. Jsou parametrizované a je tedy nutné před samotnou predikcí určit hodnoty pro dané parametry – „natrénovat“ danou metodu na známých datech.

Po identifikaci oblasti DNA sekvence, která by mohla kódovat gen u eukaryot, je dále nutné zjistit, kde konkrétně jsou kódující úseky, čili exony. Taková predikce musí pro úspěšnou translaci funkčního proteinu splňovat několik vlastností. První exon začíná start kodonem a poslední končí stop kodonem. Introny nesmí rozdělovat start a stop kodony, ale můžou rozdělit vnitřní kodony. Po sestřihu mRNA musí sekvence představovat souvislý ORF.

Predikce lokalizace intronů probíhá kombinací sensorů obsahu a signálu. Signál je v tomto případě obvyklá donorová sekvence GT na začátku intronu a akceptorová AG na jeho konci. Sensor signálu představuje očekávaná frekvence nukleotidů v okolí predikovaného začátku a konce intronu (Obr. 4).

Obr. 3: Struktura genu u eukaryotického organizmu. UTR – nepřekládaný úsek (untranslated region).

A	0.4	0.4	0.4	0.3	0.6	0.1	0	0	0.6	0.6	0.1	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.2	0.2	0.2	0.1	0.2	0.4
T	0.1	0.4	0.3	0.2	0.2	0.2	0	1	0.0	0.2	0.0	0.6	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.4	0.2	0.5	0.4	0.2
C	0.1	0.2	0.2	0.2	0.1	0.0	0	0	0.1	0.1	0.1	0.2	0.2	0.2	0.3	0.3	0.3	0.1	0.3	0.3	0.2	0.1
G	0.4	0.1	0.1	0.2	0.2	0.6	1	0	0.3	0.0	0.8	0.0	0.2	0.1	0.2	0.2	0.2	0.2	0.3	0.0	0.2	0.4

Obr. 4: Grafické znázornění frekvence nukleotidů v okolí rozhraní exonů a intronů u pěti lidských genů pro interleukiny a korespondující váhová matice. Intron začíná na pozici 7.

vytvořil Institut biostatistiky a analýz Lékařské fakulty Masarykovy univerzity

A	0.4	0.4	0.4	0.3	0.6	0.1	0	0	0.6	0.6	0.1	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.2	0.2	0.2	0.1	0.2	0.4
T	0.1	0.4	0.3	0.2	0.2	0.2	0	1	0.0	0.2	0.0	0.6	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.4	0.2	0.5	0.4	0.2
C	0.1	0.2	0.2	0.2	0.1	0.0	0	0	0.1	0.1	0.1	0.2	0.2	0.2	0.3	0.3	0.3	0.1	0.3	0.3	0.2	0.1
G	0.4	0.1	0.1	0.2	0.2	0.6	1	0	0.3	0.0	0.8	0.0	0.2	0.1	0.2	0.2	0.2	0.2	0.3	0.0	0.2	0.4

A	0.4	0.4	0.4	0.3	0.6	0.1	0	0	0.6	0.6	0.1	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.2	0.2	0.2	0.1	0.2	0.4
T	0.1	0.4	0.3	0.2	0.2	0.2	0	1	0.0	0.2	0.0	0.6	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.4	0.2	0.5	0.4	0.2
C	0.1	0.2	0.2	0.2	0.1	0.0	0	0	0.1	0.1	0.1	0.2	0.2	0.2	0.3	0.3	0.3	0.1	0.3	0.3	0.2	0.1
G	0.4	0.1	0.1	0.2	0.2	0.6	1	0	0.3	0.0	0.8	0.0	0.2	0.1	0.2	0.2	0.2	0.2	0.3	0.0	0.2	0.4

A	0.4	0.4	0.4	0.3	0.6	0.1	0	0	0.6	0.6	0.1	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.2	0.2	0.2	0.1	0.2	0.4
T	0.1	0.4	0.3	0.2	0.2	0.2	0	1	0.0	0.2	0.0	0.6	0.2	0.4	0.2	0.2	0.3	0.4	0.2	0.5	0.4	0.2
C	0.1	0.2	0.2	0.2	0.1	0.0	0	0	0.1	0.1	0.1	0.2	0.2	0.2	0.3	0.3	0.3	0.1	0.3	0.3	0.2	0.1
G	0.4	0.1	0.1	0.2	0.2	0.6	1	0	0.3	0.0	0.8	0.0	0.2	0.1	0.2	0.2	0.2	0.2	0.3	0.0	0.2	0.4